多倍体(polyploid)现象在植物界中早已存在，特别是在有花植物中最为普遍。据报道，自然界中大约30%～35%的被子植物，70%的禾本科植物属于多倍体，多倍体在植物的进化和新物种的形成过程中起着十分重要的作用。多倍体果树一般具有生长健壮、枝粗、叶厚、果大、少籽或无籽、产量高、适应性强和抗逆性强等优点，这些优点可用无性繁殖使其保持稳定而不出现分离，因此，多倍体育种倍受果树育种学家青睐。

　　枣(Ziziphus jujuba Mill.)为鼠李科(Rhamaceae)枣属(Ziziphus Mill)植物。我国枣属植物有18个种，枣有4个变种，700多个品种。枣原产我国，为我国特色和优势果树，在我国分布极广，除黑龙江外，其他各省、市、自治区都有分布，是我国当今第一大干果和第八大果树树种，拥有世界98%的产量和100%的国内外贸易。枣树在生产栽培中投入少、效益高，且具有抗旱、耐涝、耐瘠薄、耐盐碱等特性，枣果实含有非常丰富的糖、Vc、cAMP以及蛋白质、脂肪、Vp、B族维生素和Fe、P、Ca、Zn等人类必需的物质，具有很高的营养价值和食疗价值。因此，近年来枣在农业产业结构调整和退耕还林工作中发挥了重要作用。并且，随着我国加入WTO，枣产品将成为我国最具优势和国际竞争力的农副产品之一。

　　枣属植物中存在大量的自然多倍体，如毛叶枣就存在四、六、八倍体类型。关于枣的多倍体研究，国内外报道很少。赞皇大枣是目前发现的惟一的自然三倍体品种，该品种适应性强，耐瘠薄，坐果稳定，产量较高，果实品质优良，具备一般多倍体的优点，现已大面积推广。对我国在枣方面进行的多倍体育种研究进行了简要的概述。

　　1 诱导枣多倍体的方法

　　1.1 物理方法诱导多倍体

　　自从1890-1901年间俄国学者格拉西莫夫用人工方法获得多倍体后，许多科学工作者都进行了人工诱导多倍体有效方法的探讨。可以诱导多倍体的物理方法有温度的激变、机械创伤、离心力、紫外线、X射线和渗透压的改变，这些方法的普遍缺陷就是诱导率低，化学药剂的使用完全取代了利用物理手段来获得多倍体，这些方法已不再使用。

　　1.2 化学药剂诱导多倍体

　　可以诱导多倍体的化学药剂很多，如：秋水仙素、吲哚乙酸、苯及其衍生物、有机砷制剂、磺胺剂及其他植物碱、麻醉剂和生长素等数百种，但使用最多，最有效的为秋水仙素。秋水仙素阻碍纺缍丝的形成，使中期染色体不能分裂到两个细胞中。从而导致了细胞中染色体数目的加倍。利用秋水仙素处理分裂旺盛的组织就可以获得理想的多倍体，萌发的种子和生长点是最好的处理材料，常用的方法有：浸种法、滴苗法、涂抹法。秋水仙素处理的浓度和时间因处理品对象的不同而异，秋水仙素浓度在0.01%～1.0%内据报道都是有效的，在对某一植物作初次诱导试验时，一般采用低浓度长时间的处理方法。

　　蒋洪恩、刘孟军等以二倍体冬枣、临猗梨枣和辣椒枣的新生枣头为试材，经秋水仙素溶液诱变处理，首次获得了临猗梨枣、冬枣和辣椒枣的四倍体及辣椒枣的八倍体材料，不同品种诱导多倍体的最佳处理时间和浓度组合不同。临猗梨枣的最佳处理组合为0.15%的秋水仙碱处理18h，诱变率为50%；辣椒枣和冬枣的最佳处理组合分别为0.1%的秋水仙碱30h和0.15%的秋水仙碱18h，诱变率均为43.3%。

　　宁强、刘孟军等以二倍体冬枣和梨枣为试材，在诱导生成愈伤后，以秋水仙素为诱变剂对愈伤进行诱变，首次由愈伤途径获得了四倍体植株：不同品种、不同秋水仙素浓度和处理时间对愈伤的诱变效果不同，对于梨枣而言，秋水仙素浓度0.05%，处理24h效果最好，愈伤变异率达到13.3%；对于冬枣来说，秋水仙素浓度0.05%，处理18h效果最好，愈伤变异率达到6.7%。

　　1.3 利用组织培养技术诱导多倍体

　　利用组织培养诱导多倍体的方法是最近十几年科研工作者采用较多的方法，该方法诱导率高，并可以克服同源多倍体孕性低的缺陷，有较大的发展潜力。使用的前题必须是该植物的组织培养技术已经成熟。组织培养中使细胞染色体加倍的因素很多，如叶片、茎段、根系等。据Singh报道不同培养基的物理状态对二倍体与多倍体的选择压力不同。培养基中加入适当浓度的2，4-D及其他激素也可增加培养物中多倍体细胞的含量。但实际应用中利用最多的仍为利用秋水仙素进行多倍体诱导。利用秋水仙素诱导多倍体可以把秋水仙素加入培养基中进行诱导培养，也可以先用秋水仙素溶液浸泡培养物然后再接种到培养基上进行培养。

　　严仁玲等在组培条件下成功的将二倍体金丝小枣加倍成了四倍体植株。王娜、刘孟军等以二倍体冬枣和酸枣的二倍体组培苗为试材，以秋水仙素为诱变剂，在组织培养条件下首次获得了酸枣和冬枣的纯合四倍体植株。不同诱变材料、不同处理方法对组培苗的诱变效果不同，以丛芽混培最高，依次为茎段浸泡、丛芽浸泡、茎段混培。酸枣和冬枣丛芽的最佳处理时间和浓度的组合均为含50mg/L秋水仙素的MS培养基混培处理40d，诱变频率分别为36.67%和26.67%；酸枣茎段最佳处理时间和浓度组合为0.4%的秋水仙素溶液处理4d，诱变频率为23.33%；冬枣茎段最佳处理时间和浓度的组合为0.4%的秋水仙素溶液浸泡处理2d，诱变频率为16.67%。相比之下，混培法更适合于丛芽诱变，浸泡法更适于茎段诱变。酸枣的诱变频率明显高于冬枣。
　　
　　宁强、刘孟军等等以冬枣和辣椒枣叶片为试材，在离体条件下诱导愈伤的形成，并利用秋水仙素对愈伤进行浸泡法和混培法处理。不同材料、不同处理方法和不同培养时间对愈伤的诱变效果不同。对于冬枣而言，浸泡叶片愈伤，秋水仙素浓度0.01%处理4d，变异率最高为13.3%；混培法中，对叶片进行10d的预培养，秋水仙素浓度0.004%处理15d的变异率最高，达6.7%。

2 多倍体的鉴定

　　2.1 形态学鉴定

　　染色体数目的变化导致了植株外部形态发生很大的变化。“巨大性”是多倍体植株的普遍表现，形态学鉴定方法直观、简便，使用非常方便。N.K.Dwivedi等发现，二倍体蓝莓(blueberry)加倍成为四倍体后，株高增加，侧枝数量增多，叶子变厚，颜色加深。Notsuka，K等发现，四倍体葡萄的果实体积增大，平均为二倍体的1.3倍。刘庆忠等发现四倍体皇家嘎拉苹果(Malus domestica Borkh)节间变短，叶片变圆，叶形指数变小。形态学的观察和细胞学鉴定的结果基本是一致的，说明形态学鉴定是对多倍体进行初选的较好的方法。

　　蒋洪恩等人的试验表明：加倍株外部形态均表现出了多倍体的一般特性。具体表现为叶片变大变厚、叶形指数变小；叶色变深、叶表面皱缩粗糙；叶缘锯齿增大、锯齿数目减少；枣头节间长度变短、皮

　　孔增大、皮孔密度变小等。

　　宁强等人的试验表明：诱变得到的四倍体与其二倍体对照相比有许多不同，具体表现为叶片变厚、革质化加重，叶色变深，叶长、叶宽增大，叶形指数变小，叶缘锯齿增大、锯齿数目减少，且变异植株

叶片全部表现多倍体特征。

　　2.2 细胞学鉴定

　　对经过人工诱导的植株进行细胞学的观察是鉴定是否为多倍体最直接最有效的方法。细胞学效应中最根本的特点就是染色体的加倍。二倍体材料经过秋永仙碱处理后，一些材料细胞的染色体全部加倍，成为同源四倍体(autotetraploid)；一些材料二倍体与四倍体细胞并存出现嵌合体(cytochimaeras)现象；一些材料二倍体、四倍体细胞以及更高倍性的细胞混合而形成混倍体。Notsuka K等用秋水仙碱处理葡萄的茎尖，同时得到了四倍体(tetraploid)和嵌合体植株。

　　植物倍性增加在细胞学效应中的另一个特点是叶绿体的增多，这在各试验中均有报道。戴洪义在对四倍体与二倍体葡萄细胞内叶绿体数量进行比较时发现，前者为后者的两倍。

　　细胞体积的增大也是植株倍性增加的标志之一。王长泉等对变异植株进行观察时还发现多倍体细胞中核仁数量有增多的现象。

　　蒋洪恩等人的试验表明：变异株的染色体数出现2n=4x=48，辣椒枣加倍株个别细胞染色体数变为2n=2x+2=26，成为非整倍体细胞；采用流式细胞计数法测定单细胞DNA含量结果显示，变异株枣单细胞DNA含量为4C，是二倍体DNA含量(2C)的两倍；在辣椒枣变异株中还发现了部分八倍体细胞。

　　宁强等人的试验表明：诱变得到的四倍体与其二倍体对照相比有许多不同，梨枣和冬枣的染色体数均为2n=2x=24条，而变异株染色体数出现2n=4x=48条，叶片气孔明显变大，气孔密度减小，叶绿体数目增多；以新生枣头茎尖或幼叶为试材，流氏细胞仪测定DNA含量表明，变异株中存在DNA含量加倍的细胞。

　　3 讨论

　　3.1 枣多倍体育种发展的前景

　　赞皇大枣是目前发现的惟一的自然三倍体品种，该品种适应性强，耐瘠薄，坐果稳定，产量较高，果实品质优良，并表现出多倍体的巨大性，现已大面积推广。20世纪80年代初期，山东果树所曾培育出了金丝小枣、圆铃枣、长红枣的胚乳三倍体植株，但一直未在生产上应用。近年来，河北农业大学中国枣研究中心用秋水仙素在田间和组织培养条件下诱变枣树多倍体，已获得冬枣、辣椒枣等品种的四倍体变异类型。

　　随着我国加入WTO，枣作为我国的特色优势产品，将成为我国最具优势和国际竞争力的农副产品之一。枣产品的开发、研制和加工作为一个朝阳产业，毕将会有一个光明的前景。所以，枣多倍体的育种工作有着很大的潜力和光明的未来。

　　3.2 多倍体的纯化

　　诱导多倍体常常出现嵌合体现象，而嵌合体的纯化通常需要长时间繁杂的过程，近年来随着组织培养技术与多倍体育种的结合使用，逐渐找到了筛选嵌合体的突破口。郑思乡等诱导经过秋水仙素处理的芦笋器官和组织产生不定芽，可以获得完全多倍体。由于不定芽一般由一个或几个表皮细胞发育而来，若这部分细胞是多倍体，则形成的不定芽即为完全多倍体。通过愈伤途径诱导多倍体，可望实现加倍后的单细胞再分化成苗，理论上这种途径所形成的四倍体均为纯合体，从而可避免嵌合体的出现，使直接诱导同质多倍体成为可能。

　　3.3 田间诱导与离体诱导

　　以往的多倍体诱导多在田间进行。近年来，生物技术的发展促进了植物组织培养结合秋水仙碱诱发多倍体的研究。目前田间诱导与离体诱导均有很大进展。

　　首先从诱变方法上来看，田间诱变常采用秋水仙素涂抹法，使诱变剂直接与生长点接触促使其发生变异的方法，该方法直接对生长点发生作用，易产生变异，但同时也加重了对生长点的伤害，较适于对秋水仙素忍耐力强的材料，田间材料较离体材料更适于该方法。在离体条件下一般采用两种方法—秋水仙素溶液浸泡法及秋水仙素培养基混培法。浸泡法实质上与前面提到的田间诱变的方法相似，即通过溶液外渗将材料加倍。由于离体组织较幼嫩，该方法对材料的伤害较重。相比之下，混培法是比较适于离体材料诱变的一种低浓度长时间的处理方法。与浸泡法不同的是，混培法中秋水仙素浓度较低，对材料的加倍作用是通过材料从内部逐渐吸收达到的，对材料伤害小。并且，离体混培法比田间诱变简便的多，不需要逐株进行处理，只需将秋水仙素加入到培养基中，同时可处理大量材料，节省了大量人力、物力。

　　从诱变材料来看，田间处理材料选择范围较少，茎尖生长点是较为常用的材料。而离体条件下材料的许多部位都可作为诱变材料，如叶片、茎尖和茎段等。在组织培养快繁条件下这些材料是可以大量满足的。同时，在成熟的组织培养体系中还可以利用更多的离体材料，如愈伤组织、小孢子、单细胞甚至原生质体等，体现了离体诱导多倍体材料选择的巨大优越性。

　　从嵌合体的分离来看，蒋洪恩认为，田间条件下可采用修剪法对嵌合体进行纯化，即在新生枣头生长过程中，不断剪除未变异枝条，可促进枣头基部隐芽的萌发或剪口处不定芽的生成，但这种方法操作繁琐，并未得到纯合多倍体植株。而离体条件下，嵌合体的分离可及时进行，且操作简便快捷。

　　从对变异株的鉴定来看，无论是田间诱变还是离体诱变，都可以通过形态观察来对诱变材料进行初期鉴定。离体条件下，还可在不影响组培苗正常生长的情况下通过检测根尖或叶片的染色体倍性来确定材料的变异情况。

　　因此，利用组织培养可以同时诱导大量材料，而且培养条件容易控制，重复性好，易于进行嵌合体的分离及多倍体的鉴定，得到的四倍体植株当年就可大量扩繁。这预示着利用组织培养离体诱导多倍体，有可能广泛适用于其他已建立高效组织培养再生体系的各种作物，从而在染色体工程中具有广泛的应用前景。

作者单位：(1 河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071001；2 河北政法职业学院园林系，河北石家庄 050061)
注明：国家科技攻关项目（2001BA502B09-04）